Ver: Introducción a Biología Molecular

Muestra: Ver Anexo: Toma de Muestra Biología Molecular.

Método:
Transcripción inversa. Reacción en cadena de la polimerasa o RT-PCR NESTED para la detección de RNA viral circulante. PCR con "PRIMERS" genotipo específicos secuenciación del producto de amplificación.
Hibridación con sondas genotipo específico inmovilizadas en nitrocelulosa.

Análisis por enzimas de restricción de los fragmentos amplificados (RFLP)

Secuenciación.

Innunogenetics (INMOLIPA): permite discriminar los tipos y subtipos de HCV y es capaz de detectar diferencias en un solo nucleótido. Se basa en la hibridización reversa de fragmentos biotinilados de la PCR ,en un segundo paso el grupo biotina del complejo streptavidina-fosfatasa alcalina y con un cromógeno apropiado. Una versión de segunda generación discrimina tipos de HCV (tipos 1 al 6 y 10) y sus mas relevantes subtipos. Permite detectar diferencias en un solo nucleótido en la 5'UR. Como HCV comprende al menos 11 tipos y más de 70 diferentes subtipos y muchos de ellos tienen una secuencia idéntica en la región 5'UR del genoma del HCV. Esto incrementa la dificultad de designar un ensayo de genotipo de alta resolución basado solo en la 5'UR.

Significado clínico:
El virus de la hepatitis C presentan gran variabilidad genómica, no solo entre los aislamientos secuenciados en diferentes zonas geográficas sino entre distintas aislamientos de individuos de la misma zona e inclusive de un mismo paciente. Dada su extensa variabilidad lo lleva a clasificarse en diferentes tipos (designados tipo 1,2,3) y en diferentes subtipos ( 1 a , 1 b ,1 c ). Se ha demostrado que el curso clínico de la infección por ciertos tipos de HCV son mas severas que la producida por otros subtipos y la respuesta al tratamiento con interferón depende de los tipos y subtipos,la carga viral y el background genético del huésped.
El HCV presenta una tasa de mutación espontanea muy elevada dando lugar a las llamadas cuasiespecies.
La zona mas conservadas son 5` NC (UTR) y el core, en cambio, las secuencias con mayor capacidad de mutación son los que codifican la cubierta (E2/NS1) mediante la secuenciación y el mapeo genomico del virus. Se describen seis genotipos, los cuales a su vez poseen subtipos según la clasificación de Simmonds, que se corresponden con los cuatro genotipos de la de Okamoto.
Si bien los genotipos de HCV tienen diferente distribución geográfica y pueden hallarse distintos genotipos en un mismo paciente, los pruebas serológicas detectan anticuerpos anti-HCV independiente del genotipo de que se trate.
El genotipo 1,(1b) tiende a producir una enfermedad hepática más grave y se asocia con una respuesta terapéutica mucho mas pobre a la administración del Interferón alfa .
Es posible que el sistema inmune del huésped ejerza una presión de selección de mutantes de escape del HCV, así como partículas vírales defectuosas capaces de evadir la respuesta inmune y de mantener la infección.

Utilidad clínica:
Monitoreo de la terapia:
Pronostico de la respuesta al tratamiento antiviral (Interferón asociado a Rivabidina).

Bibliografía:

1. LotharT. Clinical Laboratory Diagnostics: Use and assessment of clinical laboratory results, English edition, 1998.
2. Tietz N. W. Clinical Guide to Laboratory test, edited by W.B. Saunders Company, third edition, United States of America ,1995.
3. Mandel, Bennett and Dolin. Enfermedades infecciosas principios y prácticas. Editorial Panamericana, 4ª edición; Madrid, España. Año 1997